<rt id="my2yg"><small id="my2yg"></small></rt>
<acronym id="my2yg"></acronym>
<acronym id="my2yg"><small id="my2yg"></small></acronym>
<acronym id="my2yg"></acronym><rt id="my2yg"><small id="my2yg"></small></rt>
您好!歡迎訪問上海根生生物科技有限公司網站!
全國服務咨詢熱線:

15216781845

當前位置:首頁 > 技術文章 > 熒光原位雜交FISH技術服務

熒光原位雜交FISH技術服務

更新時間:2012-02-21      點擊次數:4681

FISH技術:熒光標記的原位雜交技術

 

  1974年Evans將染色體顯帶技術和染色體原位雜交聯合應用,提高了定位的準確性。20世紀70年代后期人們開始探討熒光標記的原位雜交,即FISH技術。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標本上,標志著染色體定位技術取得了重要進展。20世紀90年代,隨著人類基因組計劃的進行,由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要,FISH技術得到了迅速的發展和廣泛應用。

 

  1.原理

 

  將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛,可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應,經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

 
  

肺腫瘤細胞FISH

  2.實驗流程

 

  FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結果分析。

 

  3.特點

 

  原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在于對制備樣品的要求不高,可以通過延長曝光時間加強信號強度,故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標記系統則可克服這些不足,這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系,具有以下優點:1、熒光試劑和探針經濟、安全;2、探針穩定,一次標記后可在兩年內使用;3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確;4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列,其靈敏度與放射性探針相當;5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列;6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化,也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。

 

  缺點:不能達到100%雜交,特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。

 

  4.應用

 

  該技術不但可用于已知基因或序列的染色體定位,而且也可用于未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。

根生實驗流程

一、探針及標本的變性
(1)探針變性:將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min,立即置0℃,5~10min,使雙鏈DNA探針變性。

(2)標本變性:

①將制備好的染色體玻片標本于50℃培養箱中烤片2~3h。(經Giemsa染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片)。

②取出玻片標本,將其浸在70~75℃的體積分數70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2~3min。
③立即按順序將標本經體積分數70%、體積分數90%和體積分數100%冰乙醇系列脫水,每次5min,然后空氣干燥。
二、雜交:
將已變性或預退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標本上,蓋上18×18蓋玻片,用Parafilm封片,置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜(約15~17h)。由于雜交液較少,而且雜交溫度較高,持續時間又長,因此為了保持標本的濕潤狀態,此過程在濕盒中進行。
三、洗脫:此步驟有助于除去非特異性結合的探針,從而降低本底。
(1)雜交次日,將標本從37℃溫箱中取出,用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
(2)將已雜交的玻片標本放置于已預熱42~50℃的體積分數50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次,每次5min。
(3)在已預熱42~50℃的1×SSC中洗滌3次,每次5min。
(4)在室溫下,將玻片標本2×SSC中輕洗一下。
四、雜交信號的放大:
(1)在玻片的雜交部位加150mL封閉液I,用保鮮膜覆蓋,37℃溫育20min。
(2)去掉保鮮膜,再加150mL avidin-FITC于標本上,用保鮮膜覆蓋,37℃繼續溫育40min。
(3)取出標本,將其放入已預熱42~50℃的洗脫液中洗滌3次,每次5min。
(4)在玻片標本的雜交部位加150mL封閉液II,覆蓋保鮮膜,37℃溫育20min。
(5)去掉保鮮膜,加150mL antiavidin于標本上,覆蓋新的保鮮膜,37℃溫育40min。
(6)取出標本,將其放入已預熱42~50℃的新洗脫液中,洗滌3次,每次5min。
(7)重復步驟(1)、(2)、(3),再于2×SSC中室溫清洗一下。
(8)取出玻片,自然干燥。
(9)取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標本上,蓋上蓋玻片。
五、封片:
    可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol(可使封片液產生自封閉作用),為防止蓋片與載片之間的溶液揮發,可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20~-70℃的冰箱中的暗盒中保持數月之久。
六、熒光顯微鏡觀察FISH結果:
先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野,然后打開熒光激發光源,FITC的激發波長為490nm。細胞被PI染成紅色,而經FITC標記的探針的探針所在位置發出綠色熒光。由于本實驗使用的是Y染色體上的特異序列,因此在男性外周血染色體標本的雜交中呈陽性,即使在末分裂的細胞中,也可以觀察到明顯的雜交信號。照相記錄實驗結果
 

上海根生生物科技有限公司
地址:上海市奉賢區南橋鎮南橋路377號1幢
郵箱:genshengtech@163.com
傳真:86-021-64190979
關注我們
歡迎您關注我們的微信公眾號了解更多信息:
歡迎您關注我們的微信公眾號
了解更多信息
国产睡熟迷奷系列精品污,国产对白受不了了,国产裸体美女永久免费无遮挡,xxxx国产,无码av人妻精品一区二区三区抖音,jizz在线观看